技術ポイント　解説

沈降法によるナノセルロースの形状・形態評価
TEMPO触媒酸化法で製造したナノセルロース（セルロースナノファイバー/CNF）は､比較的軽微な機械処理で幅3nm程度まで微細化しますが､ディスクミル等機械的処理のみでナノ解繊した場合、最終的には幅15nm程度まで微細化するものの、製造途中では､様々な形状・形態が存在します。当研究グループでは､一部がナノ化したセルロース繊維（部分ナノ化セルロース）が､ゴムの特にい低伸張領域の物性を効果的に向上できることを明らかにしています。参考：「研究紹介」－「完全にナノ化しないナノセルロースの効果（ゴム補強）」　このような部分ナノ化セルロースを活用するためには、その特性を把握することが重要となります。顕微鏡的手法による形状把握、比表面積測定による解繊度合い評価は、特性把握方法として有効ですが、それだけでは十分ではありません。これらの評価方法では、必ず乾燥サンプルが必要なため、乾燥過程で特性が変化していることも無いとは言えません。湿式での評価方法としては、光散乱・回折法（粒度分布測定）、粘度・粘弾性測定などがありますが、測定は簡単ではありません。　ナノセルロースは微細かつ様々な形状を持つため、その特性は複数の測定方法で総合的に評価する必要があります。　水中に分散した物質の湿式でのサイズ評価方法として、レーザー回折式粒度分布測定はよく知られています。この方法は、粒子のサイズに依存して光が回折・散乱する現象を利用して評価しています。mm単位から数十nmまで、連続して一括で測定できる特徴があります。動的光散乱法は、粒子のサイズに依存したブラウン運動の違いをレーザーで計測してサイズを算出します。主にナノ領域の粒子（ブラウン運動する粒子）の計測で用いられています。どちらも、ナノセルロースを乾燥させることなく、濃度の調整のみで測定可能なことから、利用されている例も多いです。しかし、ファイバー状物資は、原理的な問題（測定対象は球形粒子）で、幅や長さを正確に計測することは困難ですが､特にレーザー回折式粒度分布測定は簡便かつ短時間で実施可能なため、機械的解繊過程において太い繊維が次第に微細な繊維に変化していく状況のモニタリングや品質管理として利用される事例もあります。ただし、多くの場合、得られた数値は、ナノセルロースの幅も長さも示していませんが、生成したナノセルロースが均質化すると粒度分布の幅は狭まり、数値（粒度）は一定になる傾向を示します。　ナノセルロース分散液は、放置していても分離せずにクリーム状の状態が保たれる場合がほとんどです。TEMPO触媒酸化法で製造した超微細なナノセルロースは、低濃度でも分散が維持されますが､機械処理のみで製造した幅15nm程度のナノセルロースは､セルロースそのものの比重が1.5程度であるため､希釈すると沈降します。
測定原理媒体中において球形粒子は、ストークスの式（Stokes' law）に従って沈降します。つまり、沈降速度から粒子サイズを求めることができます。この方法も、サンプルを乾燥させることなく、濃度調整のみで測定できる特徴があります。前述のように､ナノセルロース（セルロース）は比重が1.5であり、媒体である水より重たいため、沈降するはずです。しかし、多くの場合、高濃度（1wt % 程度以上）では、ナノセルロース間の相互作用などで沈降しません。また、TEMPO触媒酸化処理等による超微細なナノセルロースは、水との相互作用が強いため低濃度化しても沈降しません。そのため、沈降速度が測定可能なナノセルロースは限定されることになります。さらに、この方法も、対象は球形粒子であり、レーザー回折式粒度分布測定と同様に、ナノセルロースの幅や長さを直接的に求めることはできません。　これまでに、ナノセルロースの形状特性と沈降挙動の解析から、繊維幅との相関が高いことを明らかにしています（参考文献1）。さらに、比表面積測定結果と沈降特性が相関しないCNF系（比表面積が同程度でも沈降速度が異なる）も存在していることも明らかにしています（参考文献2, 3）。これらのことから、沈降特性評価により、電子顕微鏡観察による形状・形態観察や比表面積測定による解繊度合い評価と総合して、ナノセルロースの特性をより把握できることが分かりました。　沈降特性評価は、工業的には、製品の粒度評価の他、保存時の分散安定性や乳化物やエマルジョンの安定（分離や凝集）度合いの評価でも用いられています。参考文献１：Akio Kumagai, Naoko Tajima, Shinichiro Iwamoto, Takahiro Morimoto,Asahiro Nagatani,Toshiya Okazaki, Takashi Endo, International Journal of Biological Macromolecules, 121, 989-995 (2019), “Properties of natural rubber reinforced with cellulose nanofibers based on fiber diameter distribution as estimated by differential centrifugal sedimentation”. 参考文献2：熊谷明夫，遠藤貴士，足立真希、紙パ技協誌、73(5),66-73(2019).“沈降法によるセルロースナノファイバーの評価”. 参考文献3：Akio Kumagai, Maki Adachi, Takashi Endo, Japan TAPPI journal，73(5),57-65(2019). “Evaluation of Cellulose Nanofibers by Using Sedimentation Method”.
測定ナノセルロース分散液の沈降性の評価について、当研究グループでは､液中分散安定性評価装置（Formulaction社、Turbiscan MA2000 /Turbiscan Tower）を用いて評価しています。本装置は、サンプルを入れたサンプル管の側面を、上下に可動する光源（近赤外光：λ= 850 nm）と検出器を備えたスキャン部分で連続的に解析する装置です。サンプル管の上下方向の各部分での透過光・後方散乱光を連続的に測定することで、分散物の沈降による光透過率の変化情報を得ることができます。測定初期は、均一な分散物（ナノセルロース）により、サンプル管全体の光透過率は低い状態ですが、沈降が起こるとサンプル管上部のナノセルロース濃度は低下し、それに伴い、光透過率は向上します。この変化を経時的に測定することで、ナノセルロースの沈降特性を解析することができます。下記に示した評価結果のグラフは、参考としてパルプを原料としてディスクミルで製造した比較的均一なナノセルロースの沈降挙動です。グラフの横軸はナノセルロース分散液の入ったサンプル管の底面からの距離（高さ）を示し、縦軸は光透過率を示しています（下図のグラフでは、データ処理を容易にするため、縦方向で得られた結果を便宜的に横方向で示しています）。色の異なる複数の波形パターンは、測定開始から一定時間毎のサンプル管全体の光透過率を示しています。下図では、1分間隔で30分間測定した結果で、時間経過とともに液面付近（横軸35 mm付近）の光透過率が増加して、ナノセルロースが徐々に沈降していく過程を表しています。測定した波形パターンはナノセルロースの繊維幅や繊維形状によって変化するため、本装置での測定で得られた、ナノセルロース分散液の沈降特性から、他の方法では困難なナノセルロースの形状に関する情報を得ることができます。　当研究グループでは、0.1 wt%濃度に調製したナノセルロース分散液を、1分間隔で30分間、または30分間隔で20時間測定することで評価しました。解繊初期（ディスクミル処理では、処理回数が少ない1から3回処理）では、解繊物のサイズが大きく、比較的速く沈降するため、1分間隔で30分間測定としました。解繊度合いが高い（ディスクミル処理10回等／十分に微細化して全体が幅15nm程度になったサンプル）場合は、30分間ではほとんど沈降せず、沈降挙動の追跡が不十分なため、30分間隔で20時間の条件で測定を行いました。
プロセスの概要下図は、製造方法が異なるナノセルロースの沈降特性を評価した結果です。両者で比表面積は、ほぼ類似ですが、沈降パターンは異なっています。この違いは、枝分かれ構造や繊維表面の毛羽立ちなどに由来していると考えられます。このような両者の違いを沈降法以外では、明らかににすることは困難と考えられます。　また、下記の結果は、上記のパルプ由来ナノセルロースの沈降パターンとも，異なっています。沈降法や比表面積測定、電子顕微鏡等による形状評価など複数の評価方法の結果と総合し、ナノセルロースの本質の特性との相関関係を明確にできれば、沈降特性測定そのものは、濃度を調整した後、装置にセットして放置するのみの簡単な測定であり、品質管理技術としても有用と考えられます。
参考資料：NEDO「セルロースナノファイバー利用促進のための原料評価書」2020年3月公開装置・設備はこちら「粒度分布評価」・分散安定性評価装置（1サンプル）／　英弘精機(株)　タービスキャン・MA2000 ・分散安定性評価装置（6サンプル同時）／　三洋貿易(株)　タービスキャン・タワー

エックス線回折法によるナノセルロースの結晶性評価
木質の主要成分は、セルロース、ヘミセルロース、リグニンです。これらのうち、セルロースは結晶性を持っています。ナノセルロースは、セルロース分子の集合体であるミクロフィブリルが基本であり、セルロース結晶の本体でもあります。　木質組織は、ミクロフィブリル、つまりナノセルロースが集合・積層することで形成されています。そのため、単純には、木質組織をほぐせば、ナノセルロースを製造することができます。木質組織は、ナノ結晶であるセルロースミクロフィブリル（ナノセルロース）の集合体であるため、ほぐして得られたナノセルロースと原料の結晶性は、理論的には同じになります。　ナノセルロースの製造では、水とともに、機械処理は必須です。機械処理によるせん断力や圧力は、大なり小なりセルロース結晶にダメージを与えます。処理条件を強くしすぎたり、処理回数を増やしすぎたりすると、結晶性の低下したナノセルロースになります。ナノセルロースの結晶性は、その利用性や複合化した材料の物性にも影響すると考えられるため、その評価は大切です。
測定方法ナノセルロースの結晶性評価方法としては、比較的簡単なためエックス線回折法（粉末エックス線回折法）がよく用いられています。その他には、固体核磁気共鳴（NMR）法や赤外分光法などがあります。　ナノセルロースがセルロース100%で構成されている場合、セルロース分子配列が乱れた（結晶配列が乱れた）部分が非晶質となり、結晶成分の割合から、このナノセルロースは結晶化度60％などと示されます。しかし、原料や製法によっては、セルロース以外のヘミセルロースやリグニンも含んだナノセルロースが得られます。これら成分は、ナノセルロースの表面に堆積しています（参考１）。ヘミセルロースやリグニンは非晶質であるため、これら成分が多いと、見かけ上の結晶化度は低く算出されます。そのような場合、厳密に結晶性評価が必要であれば、NMR法等を用いる必要があります　また、エックス線回折法で得られる結晶の回折ピークは、結晶のサイズにも影響を受けます。結晶サイズが極めて小さいと、回折ピークはブロード化して、非晶質のように見えるようになります（シェラーの式／参考2）。参考1：「研究紹介」－「水晶振動子マイクロバランス法によるナノセルロース表面特性解析技術」参考2：P. Scherrer, Nachr. Ges. Wiss. Göttingen, 26 (September), 98 (1918)
測定の実際　当研究グループでは、測定を円滑に進められるように、あらかじめサンプルをペレット化します。ペレット化装置としては、赤外分光分析用のKBr(臭化カリウム)錠剤作成器を流用しています。当研究グループ保有のエックス線回折装置は、オートサンプラー（自動サンプル交換器）が取り付けてあるため、あらかじめサンプルペレットを作製しておけば、測定が一度に進行できます。
結晶化度の計算方法エックス線回折法により得られた結果を用いて、セルロースの結晶化度を算出する方法にはいくつかの方法が知られています。当研究グループでは、東京大学・磯貝明先生の提案された方法（参考文献）を用いています。以下の図に、典型的なセルロース系サンプルのエックス線回折パターンと結晶化度の計算方法を示しいます。参考文献：A. Isogai et. al., Sen'i Gakkaishi, 46 (8), 324 (1990). その他の計算方法　結晶化度（%）＝｛（200の強度－非晶の強度）/200の強度｝×100
その他の計算方法 Segal法　結晶化度（%）＝｛（200の強度－非晶の強度）/ 200の強度｝×100
参考資料 NEDO「セルロースナノファイバー利用促進のための原料評価書」2020年3月公開装置・設備「構造解析」・粉末Ｘ線回折装置　／　(株)リガク　RINT TTR3

化学処理なしで得られる幅3nmのナノセルロース（柑橘等由来）
様々な植物原料から、ナノセルロース（セルロースナノファイバー/CNF）を製造することができます。製造では、水と機械的処理が必須ですが、植物は強靱な細胞壁構造を持っているため、パルプを開始原料としても、簡単にはナノ解繊できません。繰り返しでの機械処理が必要となります。　TEMPO触媒酸化法では、原料中のセルロース分子の6位を酸化して、カルボキシル基にし、水の浸透圧低下と静電的半発により、比較的簡単な機械処理でナノ解繊が効果的に進行し、幅3nmのナノセルロース（シングルセルロースナノファイバー）を得ることができます。つまり、基本単位であるセルロースミクロフィブリルまで、微細化することができます。　一方、と木材（木粉）や木材由来パルプを、TEMPO触媒酸化法などの化学的処理を併用せず、単に機械処理のみでナノ解繊した場合、得られるナノセルロースの幅は15nm程度です。処理条件によっては、さらに微細なナノセルロースも生成しますが、量は多くありません。つまり、機械処理で得られるナノセルロースは、セルロースミクロフィブリルが複数本集合した状態にあります（なぜ、そのように状態になっているかは分かっていません）。　しかし、植物を原料として、TEMPO触媒酸化法等の化学的処理を併用しなくても、柑橘類の果皮等からは、比較的簡単な機械処理のみで、幅3nmのナノセルロースを得ることができます。柑橘類果皮等は、木材のような強靱な細胞壁構造を形成しておらず、さらに、共存しているペクチン等の影響で、セルロースミクロフィブリルの集合も制限されています。これらのことから、柑橘類果皮からは、幅3nmのナノセルロースを得ることができます。ただし、製造時に、ペクチンを完全に除いてしまうと、ナノセルロースは集合するため、ペクチンの共存が重要です。　　柑橘類以外の果物や野菜などからも、幅3nmのナノセルロースを製造することができます。野菜ジュースは、原料を機械的にすりおろすなどの方法で製造されています。そのため、ジュースには、幅3nmのナノセルロースが含まれていることが考えられます。　そこで、市販の野菜系ジュースを分析した結果、とても微細なナノセルロースが含まれていることが分かりました。
柑橘由来ナノセルロースと木材由来ナノセルロースの形状比較
野菜ジュース中の幅3nmのナノセルロース
参考文献等 1. Shou Hiasa, Shinichiro Iwamoto, Takashi Endo, Edashige Yusuke, Industrial Crops and Products, 62, 280- 285 (2014), “Isolation of cellulose nanofibrils from mandarin (Citrus unshiu) peel waste”. 2. Shou Hiasa, Akio Kumagai, Takashi Endo, Yusuke Edashige, Journal of Fiber Science and Technology, 72(1), 17- 26 (2016), “Aggregation inhibition of pectin-containing cellulose nanofibers (CNFs) prepared from mandarin peel”.