応用分子微生物学研究グループ

研究成果

線菌であるロドコッカス属細菌を宿主とした多目的用途に利用可能な生物工場創製

線菌であるロドコッカス属細菌を宿主とした多目的用途に利用可能な生物工場創製

放線菌であるロドコッカス属細菌を宿主とした多目的用途に利用可能な生物工場創製を目指す研究を中心に、主に以下のような成果が得られています。

1.ロドコッカス属細菌を宿主とした微生物変換技術の開発

これまで、ロドコッカス属細菌を宿主として組換えタンパク質生産を主目的に、各種発現ベクターの構築を行ってきました。開発したベクターは、ロドコッカス属細菌大腸菌のシャトルベクターであり、ロドコッカス属細菌で自律増殖可能な2種の複製開始起点や複数の抗生剤耐性遺伝子、そして誘導型と構成型のプロモーターを材料に、それぞれを組み合わせることで多種多様な発現ベクターの構築が可能になりました。そしてこれらベクター群を使用することにより、4度から35度前後の広範囲な温度域で発現が可能であることを確認すると共に、同一細胞内に単一から複数のタンパク質を共発現することが出来るようになりました。本発現系を用いて既存の系と比較すると、最も汎用的に用いられている大腸菌を宿主とした系では発現困難な機能タンパク質の発現・精製に成功しました。また、ロドコッカス属細菌に機能タンパク質を蓄積させた高機能型細胞を構築し利用することで、大腸菌では変換困難な物質の生産が可能になり、多様な要求に 対応可能なシステムが構築できました。

放線菌Rhodococcus erythropolisを宿主として発現ベクターの開発

現ベクターの開発

プラスミドを改良した発現ベクターによる組換えタンパク質発現技術に加え、発現ベクターの 細胞内不安定性を考慮しなくても済む安定したタンパク質の発現が期待できる系の構築も行い ました。通常、宿主細胞に導入した発現ベクターは、抗生剤によるベクター保持菌を選択・ 維持しなければ、ベクターは細胞から抜け落ちていくことがよく知られています。微生物の 大量培養による物質生産においては、発現ベクターを保持する細胞を選択・維持するために 培地への抗生剤の添加や培養後の培地処理などにおいてコストがかさみます。そこで、トランスポゾンを利用した遺伝子破壊系をまず構築し、トランスポゾンによるゲノムへの遺伝子挿入機構を利用して、任意の遺伝子発現カセット(任意の遺伝子にプロモーターとターミネーターを連結したDNA断片)をゲノムに挿入し機能タンパク質の発現を可能としました。

トランスポゾンを利用した遺伝子破壊用ベクターの開発

伝子破壊用ベクターの開発

トランスポゾンを利用した遺伝子破壊系は、ロドコッカス・エリスロポリス由来IS1415を利用して開発しました。開発したベクターは、ロドコッカス属細菌内では自律増殖できないベクターで、抗生剤耐性遺伝子と大腸菌用クローニングベクターの複製開始起点のみが宿主細胞のゲノムの不特定部位に挿入されるという特徴を持っています。そして、遺伝子破壊された菌からゲノムを精製して処理することで、遺伝子が挿入された周辺領域を含むプラスミドとして大腸菌から回収してくることが可能になりました。このことから本ベクターは、遺伝子が無作為に破壊された細胞のライブラリー構築と破壊部位の容易な同定が可能になり、宿主細胞の機能解析に大きな威力を発揮すると期待されます。

シクトロームP450と共役するレドックスパートナーの共発現による微生物変換反応

生物変換反応

更に、本ベクターによりゲノムへ挿入されるDNA断片に発現カセット(任意の遺伝子にプロモーターとターミネーターを 連結したDNA断片)を導入することで、ゲノムへ直接発現カセットを挿入しタンパク質を発現することに成功しました。この手法を用いることで、発現ベクターの細胞内安定性を考慮せずに安定なタンパク質の発現が期待できるほか、発現ベクターとの併用による多段階の反応を触媒する系の構築が可能になりました。

2.リゾチーム感受性株の取得

ロドコッカス属細菌のリゾチーム感受性株の取得

ゾチーム感受性株の取得

ロドコッカス属細菌は、ペプチドグリカンとアラビノガラクタンに加え、ミコール酸を加えた3層から成る細胞壁をもつことが知られています。この細胞壁はグラム陽性菌でありながらリゾチーム対して感受性を示さないという特徴を有するため、細胞内に蓄積させたタンパク質を回収するうえで大きな障害となっていました。そこで、ロドコッカス・エリスロポリス細菌にUVを照射して構築した変異体ライブラリーの中から、コロニー個々についてリゾチーム感受性が変化した菌を探索しました。約8500株からのスクリーニングにより、2株のリゾチーム感受性株の単離に成功しました。両感受性株は、野生株に比べてリゾチームに対する感受性が100倍以上高い菌株で、培地中に低濃度のリゾチームを添加することで容易に溶菌することが確認されました。そして、本変異株を組換えタンパク質生産菌として利用することで、細胞内に蓄積したタンパク質の回収効率を著しく高めることに成功しました。
リゾチーム変異株の原因遺伝子を探索・解析すると、ltsAと名付けられたグルタミンアミドトランスフェラーゼのファミリーに属する酵素をコードする遺伝子の機能欠損によって引き起こされることが判明しました。そしてこの遺伝子産物は、ペプチドグリカンの基本骨格を相互にペプチド結合させるにために必要な反応ステップに関与していることを明らかにしました。この酵素は、他の放線菌にも広く保存されており結核菌などのLtsA相同タンパク質も同様の機能を示すことを確認し、LtsAは病原性をもつ放線菌に対する増殖阻害剤を開発する創薬研究の対象として発展する可能性があります。

3. 末端対合型アンチセンスRNAを用いた細菌遺伝子の誘導的発現抑制

 細菌は、一般に数千個の遺伝子を持っていますが、まだ機能が分からないままの遺伝子が数多く存在しています。そのような機能未知の遺伝子を解析するためには、人為的にその遺伝子が働かないようにし、その時の表現型を解析することが必要です。このために現在最も広く用いられているのが、細菌の相同組換え能 を利用して標的遺伝子をゲノム上から取り除く「遺伝子破壊法」です。しかし、遺伝子破壊法には以下の3つの欠点があります。

  1. 増殖に必須な遺伝子を標的とすることが非常に難しい
  2. 細菌種によっては、人為的に相同組換えを起こさせることが難しい場合がある
  3. 遺伝子破壊株を作成するのに時間がかかる

 一方、人為的に標的遺伝子が働かないようにする他の手段として、アンチセンスRNAを用いた方法(以下、単にアン チセンス法と言う)があります。アンチセンス法では、発現ベクターからアンチセンスRNAを転写させ、細菌ゲノム遺伝子から転写される標的mRNAにハイブリダイズさせます。これにより、標的mRNAは翻訳されず、機能しなくなります。アンチセンス法は、解析が簡便かつ迅速で、細胞の増殖に必須な遺伝子に対しても適用可能である事に利点があります。しかし、標的遺伝子の機能を十分に抑制しきれず、機能解析が出来ない場合も多くあるという欠点もありました。

末端対合型アンチセンスRNAを用いた細菌遺伝子の誘導的発現抑制

端対合型アンチセンスRNA

 以上のことから私たちは、スウェーデン・カロリンスカ研究所の Liam Good博士と共同して アンチセンス法の抑制効率を上昇させる研究を、大腸菌を用いて行いました。その結果、アンチセンスRNA配列(約150塩基対)が38塩基からなる人工逆向き繰り返し配列(inverted repeat)に挟まれたRNAを用いると、抑制効率が劇的に上昇することを明らかにしました(図1)。さらに、このアンチセンスRNA(末端対合アンチ センスRNA)を誘導型ベクターから発現させると、標的遺伝子が大腸菌の増殖に必須か非必須かにかかわず、遺伝子破壊株と同じ表現型を示す事が分かりました。このことから、末端対合アンチセンスRNAは少なくとも大腸菌の遺伝子機能解析において、非常に有用なツールであると考えられます。

4.ロドコッカス細胞による水酸化ビタミンDの合成

https://staff.aist.go.jp/y-yasutake/VD3_bioconv.jpg

放線菌Pseudonocardia autotrophicaは、ビタミンDを水酸化ビタミンDに変換することができ、この反応を担う酵素がビタミンD水酸化酵素(Vdh)です。水酸化ビタミンDは骨粗鬆症の治療薬等に用いられる物質ですが、有機化学合成の手法では効率良く合成することが困難な物質です。私たちはVdhの結晶構造解析を行い、さらには構造に基づいた変異導入や進化工学的手法により、高いビタミンD水酸化活性を示す変異体を複数取得しました。さらには、Vdh高活性変異体をロドコッカス細胞で発現させ、ナイシン処理により基質の細胞膜透過効率を向上させる技術を用いる事で、非常に高効率に水酸化ビタミンDを合成させることに成功しました。


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